蝴蝶兰属热带气生兰,花形似蝴蝶,因而得名。其花形态美丽,色彩丰富,花期长,在热带兰中有兰花皇后之美称,是近年来最受欢迎的洋兰之一。蝴蝶兰是单茎性气生兰,植株极少发育侧芽,且种子极难萌发,对其进行常规性的繁殖,增殖速度很慢。因此,多采用组织培养的方法对其进行快速繁殖,以达到工厂化育苗的目的。
1.外植体
蝴蝶兰的快速繁殖可选用的外植体有茎尖、茎段、叶片、花梗腋芽、花梗节间、根尖等,其方法各异,难度各有高低。
2.采样、消毒与初代培养
选用的外植体不同,其采样、消毒与初代培养的方法也不相同。下面分别就各种方法做一介绍:
(1)花梗腋芽培养
将蝴蝶兰花梗剪下,用75%酒精棉球擦拭,切成约5厘米的每节带芽小段,仔细除去苞片,防止伤及嫩芽,然后用2%次氯酸钠溶液消毒20分钟,其间不停地摇动。消毒后用无菌水冲洗3～5次,放到培养皿中。用4号解剖刀将两端各切去0.5厘米,芽体朝上插接在1/2MS+3毫克/升6苄基腺嘌呤培养基上。培养基中还需加入蔗糖20克/升,水解乳蛋白1克/升,琼脂8克/升,活性炭1克/升,调pH值为5.6。
(2)茎尖培养
茎尖是组培成功率较高的部位,但蝴蝶兰的茎尖深藏于叶片夹缝中,分离和消毒都比较困难。茎尖的取材有两种方法:一是将除去叶片的茎用水冲洗,再用10%的漂白粉溶液作表面灭菌15分钟(每100毫升消毒液加1滴吐温20),除去叶原基后,再用5%漂白粉液灭菌10分钟,然后用无菌水冲洗。
切取茎尖和各叶基部的腋芽,大小约2～3毫米,接种到培养基上,用添加15%椰乳的V&W培养基进行液体培养,或加9克/升琼脂进行固体培养。培养温度为25℃,光强2000勒克司,每天光照时间为16～24小时。液体培养以160转/分钟速度做震荡培养,7～10天再转至新培养基。从开始培养算起,1个月后转到固体培养基。在这种条件下培养1个月即可形成原球茎状球体,以后可继代增殖。二是先诱导花梗侧芽成为植株,再利用试管苗的茎尖进行培养。其方法是:在双目镜下剥取约0.3毫米大小的茎尖,接种到MS(附录表11)+3毫克/升6苄基腺嘌呤固体培养基上,在温度(25±2)℃,光强1500勒,每天光照10小时条件下培养。14天可见茎尖膨大,呈浅绿色半球状,3个月后,长成桑果状原球茎状体,组织块6毫米。此方法最大的优点是免去了外植体消毒的程序,成功的可能性较大。
(3)花梗节间的培养
正在伸长的蝴蝶兰幼嫩花茎具有分化原球茎的能力,因此可采用快速伸长的花梗节间作培养材料。从花梗可见至其后的45天之间,全部幼嫩花序以及花梗等具有细胞分裂能力的节间组织,最有利于诱发原球茎形成,成功率可达62.9%～77.1%。从第一花蕾可见起,随花梗的发育分化,原球茎的比率下降,能作为外植体的节间也愈短。具体操作方法为:切取花梗节间,进行表面消毒,然后斜切成1～1.5毫米厚的薄片,平放在固体斜面培养基上。培养基配方为:1.2倍的V&W无机盐,加100毫克/升肌醇,维生素B1、B6和烟酸各0.5毫克/升,1毫克/升6苄基腺嘌呤,2%蔗糖,0.8%琼脂。置温度(26±2)℃,光强500勒,每天光照16小时的环境下培养。
(4)叶培养
从3～4月龄蝴蝶兰植株上取幼叶,用自来水冲洗干净。在超净工作台上,叶片用75%酒精消毒30秒,然后用无菌水清洗2～3遍,再用0.1%升汞溶液浸泡11分钟,最后用无菌水冲洗4～5遍。用无菌手术刀将叶片切成5平方毫米左右大小的小块,平放或按极性接种在MS+3.0毫克/升6苄基腺嘌呤+0.2毫克/升萘乙酸诱导培养基上(培养基中加入蔗糖20克/升,琼脂12克/升,椰汁200毫升/升),近轴面向上。培养条件为:温度25～28℃,光强1600～2000勒,每天光照10～12小时。幼叶切块在诱导培养基上培养1～2个月后,从每个叶片组织块上可产生1～7个不等的原球茎。
(5)根组织培养
取正在培养的花梗苗,切取根尖长约1～1.5厘米,并用解剖刀切去尖端约1毫米,露出根的分生组织,接种于根尖诱导培养基MS+8～12毫克/升6苄基腺嘌呤+0.5～1.0毫克/升萘乙酸+10%椰乳,附加3%蔗糖,培养基中加入一块泡沫海绵,pH5.4～5.6;液体震荡培养(30转/分钟),培养温度(27±2)℃,光强1000～2000勒,每天光照10小时。20天左右材料膨大且表面颜色明显变深,60天后根分生组织部位开始有分化芽,分化率约为60%。再过45天左右,切下分化芽,转入原球茎诱导培养基2/3MS+1～3毫克/升6苄基腺嘌呤+0.5～1.0毫克/升萘乙酸+10%椰乳,加蔗糖3%,琼脂0.7%。经2个月可形成原球茎。
3.继代培养
蝴蝶兰早期原球茎状球体外观象瘤状愈伤组织,继续培养可见表面突起一个个圆球,部分表面细胞分化出根毛状物。在原球茎球状体形成后,无菌条件下将原球茎取出切割成几小块,切块不可太小(直径>2毫米),转入MS+2.0毫克/升6苄基腺嘌呤+0.5毫克/升萘乙酸(加蔗糖20克/升,琼脂12克/升,椰汁200毫升/升)继代培养基中,进行增殖培养。或在原球体的诱导时,以1/2MS为基本培养基,激素以2毫克/升6苄基腺嘌呤+0.2毫克/升萘乙酸,配方中均加入糖20克/升,琼脂8克/升,调pH值5.6,也可获得理想的效果。培养60天左右,再进行分割转移。通过这种方式,原球茎可成倍增长。
4.小植株的培养
将不需继代的原球茎,在无菌条件下,切开丛生小植株,将小植株转入育苗培养基上培养。育苗培养基可选用1/2MS+1.5毫克/升吲哚丁酸+0.05毫克/升萘乙酸,并加入蔗糖20克/升,琼脂12克/升,活性炭5克/升,椰汁200毫升/升;或2/3MS+香蕉100克/升,加蔗糖30/升,琼脂7克/升。此后,将其转入1/2MS+0.8毫克/升萘乙酸的生根培养基。不久,小植株生根。当小植株长到一定大小时,移入温室。切离丛生小植株时,基部未分化的原球茎及刚分化的小芽应接入诱导培养基中,作为种苗。一段时间后,将长大的种苗移出,种植,小苗及原球茎可继续增殖与分化。
5.试管苗出瓶移栽
当小植株长至4厘米左右,叶3～4片,根2～3条时,即可移栽。此时将小植株带瓶移入温室内,1～2周后,再将瓶塞半开或完全打开炼苗3～5天后,取出组培苗,用自来水洗净其根部的培养基,将根部放于50%多菌灵水溶液中消毒2小时,药液浓度为1000倍,晾干后即可栽植于水苔穴盘中。刚定植的植株,温度白天以20～25℃为宜,夜间以18～23℃为宜。以后,温室内日温以25～29℃为宜,夜温以20～24℃为宜。湿度以80%～90%为好,以后逐渐保持在70%左右。初期光照不宜太强,一般以1500～2500勒为佳。多采用遮阳网,春秋用一层遮阳网遮光50%左右,夏季用双层遮阳网,遮光70%左右,冬季可适当减少遮荫。缓苗后(两周左右)逐步提高光照强度至6000～8000勒。蝴蝶兰根部忌积水,水分过多,易引起根系腐烂。刚出瓶的小苗应勤补水,中苗或大苗根据干湿程度浇水;一般情况下,在盆内基质表面已变干,盆面水草微发白时再浇水。春季可4～5天浇水1次,保持盆内基质潮湿即可。浇水时要让整个基质湿透。浇水时间以上午或清晨为佳。幼苗移栽初期不可施肥,定植后1个月,可喷施液肥。
